Descripción

Este Texto-Guía comprende a los contenidos de la asignatura denominada TÉCNICAS DE EXPERIMENTACIÓN EN BIOQUÍMICA, que se imparte en el primer curso de la Titulación de Bioquímica. De acuerdo con el actual plan de estudios (año 2000), consta de dos créditos teóricos (20 horas) y seis créditos prácticos (60 horas). La asignatura es eminentemente práctica.

Trata de dar al alumno una visión de los fundamentos básicos y la aplicabilidad de una serie de técnicas ampliamente utilizadas en el laboratorio de Bioquímica. Estas técnicas están relacionadas con los métodos de rotura celular para extraer una biomolécula, la caracterización del rendimiento del proceso, cómo se puede concentrar la biomolécula, separar los residuos de la extracción y purificar orgánulos, y técnicas de purificación por diferentes tipos de cromatografía de biomoléculas, así como el uso de algunos tipos de biomoléculas muy específicas para construir sistemas dedicados a análisis y control.

A lo largo de la parte teórica se refuerzan los conocimientos de los aspectos relacionados con el comportamiento y uso de materiales biológicos y biomoléculas frente a dichas técnicas. Dado que el conocimiento de estas técnicas es esencial para el entendimiento de muchos aspectos que se pueden explicar en otras asignaturas de la Titulación, la asignatura se desarrolla normalmente en el primer cuatrimestre del curso.

Temario.

En la parte teórica se desarrollan nueve temas relacionados con los aspectos básicos y las técnicas aplicadas a los materiales biológicos y biomoléculas.

Desintegración de tejidos, células y orgánulos para extraer sus componentes. Se plantea cómo se puede llevar a cabo la desintegración celular y la extracción de los componentes internos o biomoléculas. Se estudia el fundamento de las técnicas de rotura que se emplean en el laboratorio de Bioquímica, sus posibilidades de aplicación, ventajas, inconvenientes y posibilidades de realizar el proceso en gran escala. Se analiza la metodología que se precisa para cuantificar los rendimientos obtenidos en cada caso en función del tipo de componente o biomolécula que se quiera extraer.

Centrifugación. Se estudia la base teórica que describe el comportamiento de partículas en un medio de densidad y viscosidad conocidas y que se encuentran sometidas a una fuerza que las hace precipitar. Se explican los tipos de separaciones que se pueden realizar en función del equipamiento que se utilice (centrífugas y rotores), de la forma de realizar el proceso, y del fin que se busque. El tema finaliza analizando cómo se puede utilizar la centrifugación para obtener parámetros moleculares de biomoléculas.

Concentración del extracto. Normalmente, la realización de un extracto conlleva la adición de un tampón al tejido, célula u orgánulo que se vaya a fraccionar. La dilución que ello ocasiona no suele ser buena para la actividad biológica que se busca, además dificultar las etapas posteriores de purificación. Por ello, en este capítulo se estudia el fundamento de técnicas como la adición de matriz polimérica, la filtración, la ultrafiltración, la liofilización o el reparto en sistemas acuosos bifásicos, técnicas que permiten concentrar componentes o macromoléculas biológicas y que constituyen una etapa básica de cualquier procedimiento de fraccionamiento y purificación en el laboratorio de Bioquímica.

Cromatografía. Se estudia la base teórica de los procesos cromatográficos, en función de los principios implicados en la separación. Se plantea la cuantificación de la eficacia de un proceso cromatográfico en función de sus parámetros fundamentales: compatibilidad. capacidad, selectividad, resolución y eficiencia.

Cromatografías de reparto. Se analizan los sistemas en los que la separación se basa en un reparto entre dos fases, sin que exista interacción con el soporte. Se profundiza en el fundamento teórico y las aplicaciones bioquímicas de las cromatografías de capa fina, de gases y de permeación en gel.

Cromatografías de adsorción.  Se plantean los fundamentos de los sistemas en los que la separación depende de la interacción de las biomoléculas con una fase estacionaria sólida. Se estudian las cromatografías de adsorción, de intercambio iónico, cromatoenfoque, hidrofóbica y de fase inversa y sus aplicaciones bioquímicas.

Cromatografía de afinidad. Constituye un sistema de cromatografía de adsorción en el que la separación se basa en el reconocimiento biológico específico entre dos biomoléculas o una biomolécula y un ión metálico. Se estudia cómo se generan los adsorbentes de afinidad y se cuantifican, cómo se desarrolla el proceso, qué parámetros lo afectan y qué aplicaciones bioquímicas permite.

Cromatografía covalente. Es un sistema especial de cromatografía en el que se forma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolécula a separar. Se estudian los soportes y ligandos que se emplean y las técnicas experimentales utilizadas.

Biosensores. Se estudian estos sistemas que combinan la especificidad de reconocimiento de biomoléculas con la capacidad de generar una señal amplificable que sea proporcional al reconocimiento. Se exponen y analizan los tipos de biosensores existentes, cómo se diseñan, qué características muestran y sus aplicaciones.

Las prácticas.

La parte práctica está constituida por dos partes, una dedicada a prácticas de laboratorio y otra a prácticas de simulación por ordenador.

Las prácticas de laboratorio permiten experimentar por los alumnos muchos de los conocimientos adquiridos durante la parte teórica, desarrollando su destreza manual y adquiriendo habilidades que los capaciten para afrontar posteriormente la resolución de problemas reales de laboratorio. Estas prácticas de laboratorio están relacionadas con los siguientes aspectos experimentales:

Extracción y precipitación fraccionada de proteínas. Se adquiere práctica en los procesos de precipitación selectiva de proteínas mediante sales, así como en el manejo de datos que permitan decidir la estrategia más adecuada para la purificación de proteínas por dicha técnica.

Ultrafiltración de proteínas. Trata del montaje y operación de sistemas de ultrafiltración, así como de las determinaciones precisas para el cálculo de los parámetros que determinan su operación y caracterizan el proceso.

Purificación de lisozima de clara de huevo por cromatografía de intercambio iónico. Se plantea la purificación de una enzima (lisozima) mediante cromatografía de intercambio iónico, previa su extracción. Se adquiere experiencia en el montaje y operación del sistema, así como en la cuantificación de fracciones y el cálculo de los rendimientos y factores de purificación del proceso cromatográfico.

Cromatografía de afinidad: Determinación de constantes de afinidad. Trata de cómo se puede utilizar esta técnica para evaluar las constantes de afinidad que rigen las interacciones entre dos biomoléculas, así como utilizar dichas determinaciones para el diseño de experimentos de purificación específica y selectiva de biomoléculas.

Biosensor de glucosa. Dedicada a la construcción, calibrado y caracterización de un biosensor constituido por la glucosa oxidasa inmovilizada y un electrodo amperométrico de oxígeno para determinar glucosa.

Electrodo amperométrico de oxígeno. Medida de la respiración celular. Se plantea el montaje, calibrado y uso de electrodos selectivos de oxígeno en la cuantificación de procesos biológicos en los cuales se produzca un cambio en la presión parcial de oxígeno.

Determinación y cuantificación de ácidos grasos por cromatografía de gases. Práctica en la que se adquiere conocimientos sobre las características técnicas reales de un cromatógrafo de gases, así como de su operación y el tratamiento de los datos para obtener resultados significativos.

Parámetros cromatográficos en cromatografía líquida de alta eficacia. Se adquiere práctica en las características, modos operativos y manejo de un equipo de HPLC. Inyección de muestras, caracterización de la respuesta en función de diferentes condiciones operacionales y cálculo de parámetros característicos a partir de los resultados obtenidos.

Las prácticas de simulación por ordenador están basadas en programas interactivos con datos reales que permiten enfrentar al alumno a muy diferentes situaciones reales que tiene que resolver en función de sus conocimientos. Estos programas de ordenador proveen al alumno de una gran variedad de técnicas y posibilidades que raramente podrá ver juntas en un laboratorio y que, aunque las hubiere, difícilmente podrá utilizar pues su uso excede con mucho todo el tiempo dedicado a las prácticas de la asignatura. Le plantean al alumno un problema que tiene que resolver utilizando una gran variedad de técnicas disponibles que debe aplicar según le aconsejen sus conocimientos. En función de las decisiones del alumno, el ordenador le va ofreciendo los resultados que obtendría en cada caso, debiendo el alumno decidir el próximo paso a realizar hasta lograr el objetivo final. El alumno puede conocer en todo momento qué pasos ha dado hasta un cierto punto del desarrollo. Estos programas están relacionados con las siguientes actividades:

Fraccionamiento subcelular y centrifugación. Se trata de purificar diferentes orgánulos celulares a partir de diferentes fuentes, proponiendo los métodos y condiciones de rotura tisular y celular más adecuados y utilizando técnicas de centrifugación para obtener una fracción purificada del orgánulo seleccionado. Se dispone de marcadores adecuados para cada orgánulo, de técnicas de ensayo de dichos marcadores y de microscopía electrónica de barrido como criterio para seguir el proceso de purificación, el tiempo y etapas empleados en ello, y el rendimiento y factor de purificación alcanzados.

Purificación de proteínas. Plantea la purificación de enzimas a partir de un extracto utilizando técnicas de precipitación por sales o temperatura, así como de cromatografía (permeación en gel e intercambio iónico), cromatoenfoque e isoelectroenfoque. Se dispone de técnicas de determinación de proteína y actividad enzimática y de electroforesis (en SDS, tanto mono como bidimensional) para seguir el proceso de purificación, el tiempo y etapas empleados en ello, y el rendimiento y factor de purificación alcanzados.

Secuenciación de proteínas. El programa plantea la secuenciación de péptidos y proteínas con distintos niveles de dificultad, dependiendo de la longitud del péptido/proteína cuya secuencia el programa elige al azar. El alumno dispone de una gran variedad de técnicas para conseguir su objetivo. La evaluación se establece tanto por el nivel de dificultad alcanzado como por la consecución de la secuencia correcta utilizando la menor cantidad de péptido original posible.

Cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta eficacia. Son dos programas que plantean problemas a resolver en los que el alumno debe seleccionar la columna y el eluyente a emplear, así como las condiciones de elución a fin de conseguir alcanzar el objetivo de lograr una buena separación entre los componentes presentes en  varios problemas de diversa índole.

Índice de contenidos

Presentación.

La asignatura.

Temario y distribución temporal.

Evaluación.

Cómo usar el texto-guía.

Temas teóricos.

Capítulo 1. Desintegración de tejidos, células y orgánulos.

Capítulo 2. Centrifugación.

Capítulo 3. Concentración del extracto.

Capítulo 4. Cromatografía. Fundamentos.

Capítulo 5. Cromatografías de reparto.

Capítulo 6. Cromatografías de adsorción.

Capítulo 7. Cromatografía de afinidad.

Capítulo 8. Cromatografía covalente.

Capítulo 9. Biosensores. Fundamentos y aplicaciones

Prácticas de laboratorio.

Práctica 1. Precipitación y purificación fraccionada de proteínas.

Práctica 2. Ultrafiltración de proteínas

Práctica 3. Purificación de lisozima de clara de huevo por cromatografía de inter-cambio iónico.

Práctica 4. Cromatografía de afinidad: Determinación de constantes de afinidad.

Práctica 5. Biosensor de glucosa.

Práctica 6. Electrodo amperométrico de oxígeno. Medida de la respiración celular.

Práctica 7. Determinación de ácidos grasos por cromatografía de gases.

Práctica 8. Parámetros cromatográficos en cromatografía líquida de alta eficacia.

Prácticas de simulación por ordenador.

Práctica 1. Fraccionamiento subcelular y centrifugación.

Práctica 2. Purificación de proteínas.

Práctica 3. Secuenciación de proteínas.

Práctica 4. Cromatografía de gases.

Práctica 5. Cromatografía líquida de alta eficacia.

Soluciones a las cuestiones de evaluación del aprendizaje.